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技术文萃信息：
膜片钳实验系统配置
Sutter公司P-97玻璃电极拉制仪
Sutter公司MP-285微操纵器
一种基于玻璃微管内封接技术的膜片钳方法
EPC7/PC2/200B膜片钳系统中的光电联合检测技术的实现
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※ 疑难解答 ※
膜片钳实验系统配置
一个电生理配置有4个主要的需求：
环境需求：保持标本的健康的手段。
光学需求：显现标本以供观察的手段。
机械结构需求：稳定定位微电极的手段。
电子学需求：放大和测量信号的手段。
我们将配置分成两种类型的“典型”配置：胞外记录和单通道膜片钳记录。
胞外记录的配置
该配置主要用于记录脑片的场电位。一般目标是将一个相对粗糙的电极放置在组织的胞外空间，同时尽可能模仿体内的组织环境。因此，需要一个相当复杂的小空腔，用来对组织进行温暖、氧化、灌注。而另一方面，光学和机械结构需求则简单得多。一个解剖用显微镜，至少15cm的工作距离(配合近似垂直放置的微操纵器)，通常已经可以看到切片或大体的形态学特征。由于对定位时手的震动和电极的精确放置都没有苛刻要求，微操纵器可以选用相对粗糙的机械类型。但是，在记录过程中，微操纵器不允许有一点漂移和震动。
需要使用低噪声的电压放大器。由于信号的范围可能在10 uV 到10 mV 范围内，低噪声电压放大器的增益至少要达到1000。
单通道膜片钳记录配置
标准的膜片钳配置在许多方面与胞外记录恰好颠倒过来了。由于对环境的控制非常少，实验通常在室温下、一个无灌注的培养皿中进行。
光学和机械需求则根据实际的细胞的大小(10或20 um)有特殊的规定。显微镜应该有放大300或400倍的能力，并需要某种对照增强能力(Nomarski, Phase or Hoffman)。omarski(微分干涉)对于电极的精确放置是最好的，因为它的影像依赖于视野一个很窄的深度上，这有助于精确定位(定位不好，影像是模糊的)。Phase(相差法)用于精确定位程度要求低一些的场合，但提供了更好的对比度。Hoffman方法提供了较便宜的，稍微退化点的Nomarski版本。
最好使用倒置显微镜：
(1) (1) 这样能使电极顶端更容易被看到，因为物镜在chamber的下方，
(2) (2) 提供了更大更坚固的平台，用来固定微操纵器。
微操纵器应提供良好的，平滑的移动(最多每秒2um)。对震动和稳定性的需求决定于记录模式：是希望记录cell-attached- patch，还是cell-free (inside-out or outside-out) patch。
在cell-free- patch中，微操纵器只需要在形成封接过程中保持稳定，一旦离开了细胞，稳定就不是那么至关重要了。这通常不到一分钟。
单通道记录的放大器比胞外记录使用的要复杂得多。象Heka公司的EPC9,EPC10以及Axon公司的Axopatch200B都是非常优秀的膜片钳放大器。
组织切片膜片钳记录配置
膜片钳技术的近来扩展，切片膜片钳技术，其配置需要是体外胞外记录和常规膜片钳配置的一个组合。例如，该技术可能需要一个chamber，需要连续对切片进行灌流和供氧。大部分的其他要求，与常规膜片钳类似。光学需求与切片的厚度有关(thick-slice or thin-slice)，对thick-slice，简单的解剖显微镜就够了；而对thin-slice，显微镜则需要提供400倍的放大，良好的顶端聚焦和对照增强。
设备放置
电生理实验人员倾向于在小房间的一角独自工作。小房间通常比较安静，震动和空气流动被削减了。
首先放置显微镜是比较明智的，然后是密切联系的附件，例如chamber，微操纵器和温度控制系统(如果安装了)。基本原则是第一要保证细胞恰当的处于静止状态，第二要确认从细胞记录信息的行为没有对细胞带来连续的致命伤害。
第一原则可以通过良好的实验环境帮助实现，第二原则通过良好的光学和机械手段实现。
在显微镜周围工作，保持例如灌注阀门和微操纵器的控制要非常谨慎，避免震动。理想的情况是，它们放置在一个小架子上，该架子从防震台延伸出来，保证在通过显微镜观察细胞时，不会产生破坏的震动。
选择和放置电子仪器是个人偏好的事情。最低的要求是只有一个放大器和一台计算机，另外强调最好放置在一个仪器架上。一个示波器是重要的，因为，计算机通常不够灵活；而且，示波器常能展现在计算机屏幕上看不到的一些意外情况，例如计算机的采样率设置不合适时，就会丢失大量细节信息，而示波器则不会。
示波器应与眼睛水平，在示波器上面或下面直接放置微电极放大器，以便容易的调整和监视信号。
最后，计算机应放置得尽可能远，但离显微镜还是应该保持在手臂来回够得着的地方。这有助于削减显示器的辐射噪声，也能确保在使用键盘匆忙记录时不至于肘部撞击显微镜。
最后一般的建议，也许是最难注意的是：抵制十全十美的配置诱惑，只要有一半的可能性，就开始实验。
SUTTER公司P-97微电极拉制仪使用说明
一．前后面板（按钮、开关、旋钮）控制的功能及作用
1． 前面板
LCD Display： 显示程序参数
Reset： 初始化复位控制
Air Pressure： 在拉制周期的有效制冷状态期间设置空气压力的值
Keypad： 用于设置程序参数值和执行程序
0~9： 用于选择所要的程序或控制功能，当程序设计时输入数字值和作决定是/否（Yes/No）（1/0）
CLR： 进入某个程序后本键用于删除程序或数值，也用于作坡度测试（RAMP TEST）的入口
ENTER： 回车，确定新数值或程序
NEXT： 编辑时移动到程序的下一行
LAST： 编辑时移动到程序的上一行
PULL： 开始执行程序
STOP： 终止执行程序
LED Display显示：
Program(0-9)：一个程序由一行（Cycle）或多行组成（一个Cycle包括4个程序参数：HEAT、PULL、 VELOCITY、TIME，一个Cycle相当于一行程序代码）。当执行拉制一支嵌入仪器的毛细玻璃管时，一个程序能连续拉16Cycles长度。
HEAT：HEAT是控制一个供给加热片的电流水平，设置加热片的功能，使之能熔化特定的玻璃管（组成物质及大小），在操作部分讨论坡度测试的相对值很重要，它就是你所要的加热（HEAT）值。
PULL：Pull控制强加给的拉力，一般较高的pull值会产生较小的和较长的锥形尖端。
VELOCITY：拉制杆移动速度达到一定程度，拉断电极。
TIME：TIME控制有效的制冷空气时间长度。
2． 后面板说明
1）电压转换器，国内使用220V，应使Δ对准220V。
2）电源接口及保险丝（电源开关在左侧面）。
二．安装及使用
1． 使电压对准220V，并插上电源线。
2．打开左侧的开关。
3． 安装玻璃管。
4． 运行RAMP TEST坡度测试，这测试是让你确定加热值，加热值能够熔化玻璃但又不至于烧断加热片。当你第一次使用拉制仪或更换加热丝、更换不同型号的玻璃时，都应该作RAMP TEST坡度测试，然后把RAMP TEST的值当做你的新编辑的程序的HEAT值。下面是运行RAMP TEST的步骤：
* 进入任一程序（按0-9 Enter回车）。
*按清除键<CLR>进入控制功能。
*按<0>不要清除参数数值。
*按<1>即能运行RAMP TEST 坡度测试。
*安装玻璃管和按<PULL>。
* 记录RAMP TEST值，将用于设置HEAT。
运行RAMP TEST时幸韵孪窒蠓⑸?BR>*HEAT值逐一增加。
*当加热值达到一定程度开始软化玻璃时，拉制杆将有小的移动；
*当移动速度达到一定程度，加热关闭。
*RAMP TEST值也不再增加并显示出来。
做完RAMP TEST后记下它的值按RESET。
5． 进入<0>显示程序0，光标将闪烁在HEAT，检查参数是否符合RAMP TEST值，否则改变它，按PULL。
6． 松开夹子旋钮拿出微玻璃管。
*按RESET退出程序0；
*按<1>进入程序1再做测试。
三．注意事项
1，安放加热片要在吹气孔的正中间，不能和微玻管有任何接触。
2，程序0、程序1是系统设置的程序，配合随机器的微玻管作显示用，用户要根据自己的需要先通过RAMP TEST确定HEAT值，再不断调整PULL、VELOCITY、TIME值，使之做一步二步甚至多步拉制达到自己的应用目的。
（详细使用请查阅英文使用说明书）
EPC7/PC2/200B膜片钳系统中的光电联合检测技术的实现
摘 要： 本文系统介绍了荧光测钙系统的光源选择，在Heka系统和Axon系统中的实现。对于大量应用Axon膜片钳的实验室扩展系统功能时，具有参考价值。
关键词: 膜片钳系统，荧光测钙
【引言光电联合检测技术】
细胞内自由钙离子浓度及其变化在细胞生理活动中有着重要的作用，是细胞信畔低持械闹匾方?/SPAN>,调节着肌肉收缩、分泌活动、电兴奋性等诸多重要的细胞功能。在不同生理条件下测定活体细胞的钙离子浓度是细胞生物物理研究的一个重要内容[1] 。由于以荧光标记法测定活体细胞[Ca2+]i具有快速、无损伤等诸多优点，故基于荧光标记法的活细胞钙离子浓度检测系统在目前得到了广泛应用。
Neher等于1986年将膜片钳技术与Fura-2荧光测钙技术进行了有机的结合。即在做全细胞之前，以孵育的方法或经电极扩散的方法使荧光染料Fura-2进入细胞内，对细胞进行荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞膜电容等多指标测量，从而得出同一事件过程中各种因素同时变化的情况，分析诸参量间的相互关系，揭示出更多的细节信息[?]。目前，这种光电联合检测技术已经发展得非常成熟，在单细胞电生理多变量检测实验中得到广泛应用。
比较典型实现的是德国HEKA公司的EPC9/10膜片钳系统和德国TILL公司的Poly4/5荧光测钙系统的集成[?]。而国内许多膜片钳实验室运行着大量的EPC7/PC2/200B膜片钳系统，一般却没有合适配套的荧光测钙系统，尤其在EPC7/PC2/200B膜片钳系统与荧光测钙系统的集成应用方面，还没有合适的介绍。
根据EPC7/PC2/200B系列放大器和 其配套软件包的功能，利用TILL-Poly4/5和Sutter- DG4，TILL-FDU，我们首先实现了基于Axon pClamp软件的光电联合检测系统，可以满足部分实验需求。在此基础上，我们开发了CytoClamp软件包，该软件完全兼容pClamp软件并提供了完整的光电联合检测功能，全面支持EPC7/PC2/200B膜片钳放大器。
【系统实现】
如图，是一套完整的基于EPC7/PC2/200B膜片钳放大器的光电联合检测系统。荧光测钙部分可分为光源模块、显微镜模块、荧光采集模块（如图1所示）。膜片钳记录部分则由放大器，微操，膜片钳实验软件包等构成。单色激发光源输出的单色激发光通过光纤与耦合器进入显微镜光路并聚焦于样本平面，激发细胞中的荧光探针发出荧光，荧光信号通过PMT /CCD记录。
【荧光测钙系统中的光源和检测设备】
【光源】一般选用从紫外(300nm )到黄绿光(595nm ) 这段波长范围内的光谱比较平坦的氙灯。荧光显微镜中常规使用的汞灯，其光谱不够平坦，只在某些特殊波长位置有很大的能量峰，不适合用于动态定量检测。氙灯光源需要保证输出的激发光波长可以快速切换，有足够的输出能量密度，有足够的光谱纯度。
目前应用较多的单庠词堑鹿?/SPAN>TILL公司的Poly4/5和美国Sutter公司的DG-4。Poly4,5的输出波长在260nm到650nm之间连续可调，在340nm/380nm之间波长切换时间小于1ms，光谱带宽15nm，控制方式：外加模拟电压控制波长切换，RS232控制，本地编程控制。
Sutter DG-4输出波长在300nm到700nm之间，有4个单色滤镜可以使用，对于典型的fura-2荧光染料，可使用340nm/380nm的单色滤镜，波长切换时间2ms。控制方式: TTL电平控制对应的滤镜，RS232控制，并行口控制，本地编程控制。
【显微镜】具有激发光引入光路的荧光显微镜，例如Olympus IX70/71。
【检测设备】如果只关心某个区域内的平均荧光亮度，即光度术检测，我们可以使用高灵敏度的光电二极管或光电倍增管。如果关心荧光影像，则需要使用CCD。我们在这里介绍的荧光光度术检测。我们以德国TILL公司的荧光检测FDU组件为例。FDU组件包含ViewFinder、光电二极管、信号放大调理模块，FDU的输出信号可直接输入到数据采集装置上。
【Fura-2显微荧光测钙技术的原理】
图2荧光染料测游离钙浓度的基本原理
A: 荧光检测设备框图；B:fura-2激发光谱曲线；C:双波长测量时序图
在激发荧光波长为340nm左右时，当fura-2结合了钙时，其荧光强度上升；而在激发荧光波长为380nm左右时，当它结合钙时，荧光强度会下降；在fura-2的等消光点360nm时(图2-B中箭头所指位置)，fura-2的荧光强度与钙浓度无关。这样，自由钙浓度可以直接由两个激发波长上的荧光强度的比值来计算出来，即双激发波长荧光法。这种比值法可排除因Fura-2本身浓度的变化、光学通路的变化、以及仪器灵敏性的变化等因素引入的误差。选择对钙离子不敏感的激发波长360nm则是用来反应细胞内荧光染料的总量，可以监视细胞内染料总量变化的过程。
计算胞内游离钙离子浓度的公式如下：
其中Keff为有效结合常数。R为两种激发波长下荧光强度的比值，即R＝F(λ1)/F(λ2)。当λ1为340nm, λ2为380nm时，R＝（F340）/（F380）。在再考虑背景激发波长产生的荧光FB，则还可减去背景光强度，即R＝（F340－FB）/（F380 －FB）。Rmin是在零钙浓度下的最小荧光比值，Rmax则为在高钙浓度（10mM)时的最大荧光比值。对于不同的时间、不同的系统,Keff、Rmax、Rmin这三个参数都不相同。因此，需要定期校准。
【在pClamp软件中具体实现光电联合检测】
对图3中的有关参量解释如下：积分时间 it1和it2分别是测量F(λ1)和F(λ2)时间长度，将这段时间内的荧光强度进行积分，作为这段时间内的平均荧光强度。死区时间dt是单色光源切换波长的过渡时间，死区时间内的荧光信号没有意义。循环时间st(sweep time)是一个完整的双波长测量所需要的时间，和pClamp软件中Episodic模式的Sweep概念等效。每经过一个Sweep，根据前面介绍的计算公式，可得到一个钙浓度值。
荧光检测模块FDU提供两种信号输出，一种是原始的荧光强度信号F(λ1,λ2)，根据荧光检测Sweep的it1、it2、dt、st，可计算出F(λ1)和F(λ2)和浓度值。这种荧光信号输出模式与Axon的Episodic记录模式匹配。
而另一种直接输出FDU内部解析出来的F(λ1)和F(λ2)，利用pClamp软件包中的数学通路功能，可根据浓度计算公式得到浓度值，这种信号输出模式与Axon的Gapfree记录模式匹配。
图3中给出了有关的信号流向和连接。
l l 激发光源的控制
TILL-Poly4/5光源：
Episodic模式：使用DD1322的模拟输出电压(±10V)去控制260nm-650nm的任意波长，例如-1.7V输出340nm，-1.2V输出380nm，-10V相当于关闭激发光。使用F(λ1,λ2)信号。
Gapfree模式：通过电脑的RS232通讯口下载Protocol到光源，光源单次或多次重复执行Protocol切换波长。使用F(λ1)和F(λ2)信号。
Sutter-DG4光源：
Episodic模式：使用DD1322的数字输出电压控制切换4个滤镜。使用F(λ1,λ2)信号。
Gapfree模式：通过电脑的RS232通讯口下载一个双波长切换Protocol到光源控制器，由光源控制器控制光源按Protocol切换波长。使用F(λ1)和F(λ2)信号。
l l pClamp软件的Episodic模式下测量钙浓度
pClamp软件可以控制DD1322的两个模拟输出。打开Protocol编辑窗口Wave0一般用于膜片钳刺激波形。而Wave1则可用于控制切换波长。
利用Protocol编辑模块，和编辑膜片钳实验的刺激波形一样，编辑一个控制波长切换的输出波形。
A:-10000mV(关闭激发光); 100 samples(10ms)
B:-1700mV(340nm); 50 samples(dt=5ms)
C:-1700mV(340nm); 200 samples(it1=20ms)
D:-1200mV(380nm); 50 samples(dt=5ms)
E:-1200mV(380nm); 200 samples(it2=20ms)
F:-10000mV(关闭激发光); 100 samples(10ms)
下图中，上面的波形是膜片钳测量的电流波形。下面的是荧光强度波形。对于钙浓度的计算，则可在Igor软件中计算得到。
l l pClamp软件的Gapfree模式下测量钙浓度
与Episodic模式不同，Gapfree是长时程记录，这种信号需要通过后期的软件来解析计算。这样的记录方式有一些缺点：1由于需要记录每个双波长的细节信息，因此，采样率不能太低，否则会丢失高频信息例如波形的陡峭变化部分，因此可能需要使用10KHz的采样率。而Gapfree模式是属于长时程记录的模式，可能记录十几分钟甚至几个小时，这样会造成非常庞大的数据量。
解决这个问题的办法有两个，一个是软件需要支持Gapfree模式从Episodic模式中获得数据，Episodic模式控制切换波长采样一个Sweep，然后立刻计算出相应的F(λ1)和F(λ2)，将一个Sweep长度的数据段变换成Gapfree模式中的一个数据点。这是功能最灵活的方式。但是目前版本的pClamp软件还没有这个功能。我们自己开发的CytoClamp软件实现了这个功能，该软件与pClamp软件高度兼容。
另一个方法是直接使用FDU的F(λ1)和F(λ2)，利用pClamp软件包中的数学通路功能，可根据浓度计算公式得到浓度值。
由于pClamp的Gapfree模式不能输出模拟波形，因此，无法切换波长。此时，可传送一个Protocol到光源中，然后让光源反复执行这个Protocol切换波长，记录F(λ1,λ2)信号。
【讨论】
Axon的pClamp软件是功能非常强大的软件包，其主要功能是面对神经科学中的脉冲检测、动作电位、LTP、通道电流等。而对于细胞膜电容的检测和光电联合检测等方面则实现程度不够。例如在其Gapfree模式中，许多实验人员都希望能在长时程记录中能施加电刺激。但Axon没有实现这种模式。我们开发的CytoClamp软件实现了这种模式。
英国Campden公司脑片切片机使用说明
一． 面板从右到左控制依次为：
1.电源开关。
2.浴槽控制，右为运动速度控制，左开关为浴槽的前后运动。
3.振动切片的速度控制。
二．后面板从右到左控制依次为：
1.电源插槽
2.脚踏开关插槽。
三．操作示意图
1.刀片厚度校准旋钮 2 .刀片夹紧钮
3.刀片保护罩 4.刀片位置
5.样品支持台 6.组织块
7.组织浴槽 8 .量角器
9.刀片保护罩
膜片钳实验系统震动消除和噪声消除
震动的消除方法
通过仔细的设计，是可以避免震动的危害，例如在半夜的地下室，各种白天的震动都消失了。但预防震动比仅仅靠小心更重要。需要一个用来补偿微操纵器的复杂的空气隔离实验台和一个稳定良好设计的微操纵器。
微操纵器必须是坚固而紧凑的。因此其移动部分(包括从微操纵器Holder、电极尖端、到chamber中的细胞)，这部分应尽可能短。微操纵器应靠近chamber，应直接安装在显微镜平台上。记录放大器的headstage，应直接固定在微操纵器上(而不要挂在一个杆子上)，电极也应该短。
在做膜片钳记录时，最好使用远程控制微操纵器以消除手的震动。现在，有3种主要类型的远程控制微操纵器：压电驱动、电机驱动、液压/气压驱动。
1 压电微操纵器坚固紧凑，有优异的长期稳定性，且移动非常平滑，没有改变方向时的后冲。(Burleigh PCS5x00, PCS6x00系列)
2 电机微操纵器坚固紧凑。但是，它们常常缓慢而笨拙地到位，在改变方向时，可能出现后冲。
3 而液压/气压微操纵器驱动非常快，很方便，且没有后冲，但有些型号在用于特定的设置时，可能发生缓慢的漂移。非常适合做注射微操。
防震台一般包括一个很重的厚板，放在气垫支持上。这样的防震台都比较昂贵。但是，自制的防震台也是可选的，例如将厚板放置在部分充气的内胎或网球上，特别是使用了高品质的微操纵器之后，一般可以不用昂贵的气垫防震台。
噪声消除方法
外来的电气影响(非仪器内部噪声)，可归类为3种：
辐射拾取，
磁感应拾取，
地环路噪声。
辐射拾取
辐射拾取的例子包括：从灯源和电源插座来的工频噪声(嗡嗡声hum)；计算机来的高频噪声。这种类型的噪声一般可以通过如下方法削减：在chamber和电极周围放置导体屏蔽层，使用带屏蔽的BNC电缆。屏蔽层连接到微电极放大器的信号地。一般的，法拉第屏蔽笼可以用来屏蔽微电极和chamber。
作为替代，下列方法也能削减噪声：
(1) (1) 找到噪声源，使用一个开路的示波器探针，并屏蔽它。
(2) (2) 对电极周围或部分微电极进行局部屏蔽。
(3) (3) 替换噪声源(例如液晶显示器比CRT显示器的噪声要小些)。
注意屏蔽也可能带来一些副作用，例如引入另外种类的噪声或降低带宽。不要假定商业说明书就是精确的，例如一个显微镜光源用的DC电源，就有相当可观的AC耦合；从微电极前置放大器到主放大器的被屏蔽的连接导线，可能需要额外的屏蔽。
灌注溶液的管子进入浴池，可能象一个天线，能拾取辐射噪声。如果这种情况发生了，就需要屏蔽管子。不要直接将溶液接地，而是应接在chamber中的地线上，这个地线是放大器的参考地，但可能与用于屏蔽目的的信号地不同。
磁感应拾取
当一个变化的磁通量切割一个环路线圈时，就会发生磁感应，并在线路中产生电流。这最有可能在电源的电磁铁的附近发生，并可以通过其波形来识别，其波形有非正弦的形状，频率是工频的高次谐波。将电源远离敏感电路可以削减这种噪声。如果这不可能，尝试使用双绞线以削减磁通量切割的面积，或尝试用"mu-metal."屏蔽磁源。
地环路噪声
当屏蔽层出现多点接地时，就会产生地环路噪声。磁场可能增强这个环路的噪声。而且，如果不同的接地点有些微不同的电位，就在屏蔽层中产生电流，形成噪声。在理论原则上，地环路是容易消除的：简单的将所有屏蔽层连起来，然后仅仅只在一点接地。例如，将所有连接在一起的屏蔽层在微电极放大器的信号地这个地方接地。这个信号地，再依次连接在墙上插座的power ground上(或单独的自埋接地线)。
但在实际上，这种理论指导常常由于对电子设备内部的接地电路的不清楚而失败。例如，一个BNC电缆上的屏蔽层，通常被连接在仪器的每个信号地上。而每个信号地可能被连接在一个分离的电源地上。升起BNC屏蔽层，以及(或者)断开某些电源地线(虽然这会导致触电的危险)，环路可能被打破。也可以尝试不同的电源插座，因为某些电源插座上的主要接大地的线有更低的阻抗。
计算机的地线上的噪声非常大。所以，象EPC10放大器，已经使用光纤来与计算机耦合，以消除计算机噪声。
在设置上削减噪声的逻辑步骤是首先关闭所有的设备，并互不相连，只有示波器连接在微电极放大器上。
第一步，测量当用接地的金属箔将headstage包裹起来的噪声。微电极的headstage应通过一个小电阻接地(for instance, 1 MW ) ；而膜片钳的headstage则保持开路。这提供了最小可达到的辐射噪声的一个参考数值。
第二步，连接电子设备的附加部分，并监视地环路的出现。
第三步，安装一个电极并添加屏蔽以最小化辐射拾取。
在大多数情况下，实验人员是抱着乐观的理论开始削减噪声，但结果总是依赖于经验主义。这多少有点让人感到灰心。现场的噪声排除需要耐心和经验，甚至需要一定的运气。如果有需要，可以向象CIB这样的专业公司的技术人员咨询。
膜片钳系统的电学噪声、机械震动、和机械漂移的分析与处理
摘 要： 膜片钳单通道记录系统是电生理研究的重要工具，目前已经发展成为复杂的光机电联合应用系统。在应用过程中普遍存在着电学噪声干扰(膜片钳系统各个环节的噪声)、机械干扰(记录电极尖端的震颤或缓慢漂移)。本文详细讨论并分析了这些问题，并给出有效的解决方案，对整个系统进行了优化。
关键词: 膜片钳，电学噪声，机械震动，电极漂移
膜片钳单通道记录系统是研究细胞膜(或人造膜)等双分子层上嵌合通道通透性的重要工具[1]。越来越多的实验室引进了膜片钳记录设备，广泛用于细胞膜离子通道电流的测量、细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、细胞生物学、分子生物学等各个方面[5]。
膜片钳系统已经从传统的膜片钳电学检测系统发展成为复杂的联合检测系统，包括膜片钳单细胞记录系统、膜电容记录系统、光解释放系统、荧光测钙系统，加药灌流系统，显微操作系统等多个子系统[4]。各种噪声和干扰的处理也变得更复杂了。我们曾经在国内的许多膜片钳实验室进行过安装和噪声处理。本文就膜片钳系统中普遍存在的电学噪声干扰(膜片钳系统各个环节的噪声分布)、机械干扰(记录电极尖端的震颤或缓慢漂移)等问题进行了详细分析，并给出了有效的处理方案，希望能对广大从事膜片钳技术的科研人员有所帮助。
1. 电学噪声干扰分析及处理
电学噪声可分为放大器内部的内源噪声和来自放大器以外的外源噪声。内源噪声一般都是非常低的，例如德国HEKA公司的EPC-9,EPC-10的噪声指标：探头输入端悬空，放大器Bessel滤波器，带宽选择DC-3 kHz，噪声< 0.08 pA rms[8]。而美国Axon公司的AxoPatch200B使用探头制冷技术，在相同条件下，噪声更可低达< 0.06 pA rms[6]。
我们把其他的电学噪声都可归类为外源噪声，这是膜片钳系统中主要面临的噪声。我们从放大器探头输入端开始记录观察，可发现随着插上电极夹持器、插上玻璃微电极、再放置到样本上方、入水进行封接等步骤的进行，外源噪声在逐级增加。我们可把外源噪声归类为：辐射噪声，地环路噪声，磁感应噪声[2]。
1.1 辐射噪声及其处理措施
这是一类主要的噪声。主要包括：实验室各种照明灯源和电源插座的工频噪声(50Hz)；计算机的高频噪声；各种发射设备例如手机的射频噪声等。辐射噪声可以通过接地的导电屏蔽层来隔断辐射路径进行削减。使用屏蔽笼可有效地屏蔽实验系统外部大部分空间辐射噪声。更详细的处理措施见本文后面的讨论。
1.2 地环路噪声及其处理措施
屏蔽层阻挡隔离噪声保护了探测设备，而屏蔽层本身却因为承受了辐射噪声而积累了电荷，这些电荷需要通过“接大地”来释放。在屏蔽层的形成过程中，我们有时也借用了“接地”这个术语，其实际的含义是将所有屏蔽部分用金属导线连接起来，形成等电位的屏蔽层以降低电荷流动形成的噪声，然后将所有连接在一起的屏蔽层与放大器的信号地相连，最后将放大器的信号地连接在墙上交流插座的电源地(安全地)或单独的自埋接地线[3]。要避免出现多点接地，多点接地会在不同的接地点出现细微的电位差，从而在屏蔽层中产生电流形成地环路噪声。一旦出现环路，磁场就可能进一步增强这个环路的噪声。
1.3 磁感应噪声及其处理措施
当一个变化的磁通量切割一个环路线圈时，就会发生磁感应，并在线路中产生电流。这最有可能在电源的电磁铁的附近发生，并可以通过其波形来识别，其波形有非正弦的形状，频率是工频(50Hz)的高次谐波。将电源远离敏感电路可以削减这种噪声。如果这不可能，尝试使用双绞线以削减磁通量切割的面积，例如可以将放大器的信号地线与探头电缆构成双绞线。
2. 降低电学噪声的测试
2.1 初步处理
我们在HEKA-EPC9/10膜片钳记录系统中进行了测试。首先构造一个单点接地的“等电位系统”。准备一个多孔铜棒或多端子厚铜板做等“电位节点”，然后将屏蔽笼、Newport防震台金属板面、OlympusIX71显微镜体、Burleigh-PCS5200微操控制器和微操机架、MPS加药系统控制器和加药系统机架等设备的“机箱地”各通过一根(只能是一根)导线连接到等“电位节点”上。再将放大器的“信号地”通过一根导线连接到“等电位节点”上。我们对辐射噪声，磁感应噪声，地环路噪声进行了初步的处理。然后在该条件下对系统的噪声进行初步测试，测试条件见图1-1，数据见表1中Fig.1-1行。后两个噪声数据明显偏高。我们判断从周围环境中拾取在噪声仍是主要原因。屏蔽笼内的各个设备是独立的辐射源，由于迭加效应，会某些位置会出现辐射增强点。为了降低这些辐射点对电极工作位置(一般是样本上方，显微镜聚光镜下方)的影响，我们考虑在chamber和电极周围再放置第二层屏蔽。
2.2 加强局部屏蔽
第一步，阻挡来自chamber下方的噪声。利用显微镜上的某些扩展螺孔，将接地的屏蔽层延伸到chamber的下方，只保留足够的空间用于移动chamber。并用接地锡箔纸屏蔽环绕探头的输入端(图1-2)。对噪声的改善见表1中Fig.1-2行。第二步，为了消除来自chamber上方的干扰。用接地锡箔纸形成漏斗状，只保留一个孔通过照明光(图1-3)。对噪声的改善见表1中Fig.1-3行。第三步，我们将chamber的大部分位置用接地的锡箔纸包起来，以消除chamber周围的噪声，并将漏斗状锡箔纸拉低，形成了一个环绕样本的接地窗帘(图1-4)。对噪声的改善见表1中Fig.1-4行，噪声得到了明显的改善。
图 1. 探头噪声测试的优化过程。
1-1：起始探头位置；1-2,1-3：屏蔽来自chamber下方和上方的噪声；1-4：chamber被完全屏蔽。
表 1. 不同屏蔽条件下的噪声测试数据(单位：pA RMS)
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open-circuit headstage |
headstage+holder |
headstage+holder+filled pipette |
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Fig.1-1 |
0.12 |
0.92 |
1.56 |
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Fig.1-2 |
0.093 |
0.43 |
0.65 |
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Fig.1-3 |
0.095 |
0.37 |
0.46 |
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Fig.1-4 |
0.083 |
0.094 |
0.11 |
2.3 定位屏蔽笼内的干扰源
当探头旋转到接地屏蔽窗帘的边缘时，离开局部屏蔽的保护，我们观察到噪声明显增加到1.2pA RMS，表明屏蔽笼内还存在较强的辐射源。屏蔽笼内的各种辅助设备，例如显微镜、微操、加药灌流系统、恒温系统，都是潜在的辐射源。这些辅助设备应该使用金属的机箱对其内部元件构成良好屏蔽，并且采用直流供电。使用交流供电的设备或功率较大的设备都应尽可能放置到屏蔽笼外面，或尽可能缩短电源线在屏蔽笼内的长度。虽然显微镜光源用是直流电源，但仍有相当可观的交流耦合。电源线中流动的电流强度变化或频率变化都会产生很明显的辐射噪声，因此只要可能，就应使用细金属网或锡箔纸等包裹电源线，形成一个附加的屏蔽层。灌流加药系统灌注溶液进入chamber的管子也需要屏蔽。从探头到主放大器的探头电缆，最好能再进行屏蔽，并且将放大器的信号地线与探头电缆构成双绞电缆。所有的信号线都应使用带屏蔽的BNC电缆，所有屏蔽层都必须导通以形成等电位点并最终连接到一个公共接地端子上。这些处理措施基本上可以消除主要的辐射干扰。
我们将探头作为一个探测天线，帮助检查屏蔽笼内的噪声分布和方向，发现接光电联合检测系统中的光电管方向辐射较大。在将光电管的壳体和电源线用锡箔纸包裹后，噪声从1.2pA RMS下降到0.57pA RMS。按照类似的方法，对整个系统进行了仔细的检查和充分屏蔽，噪声下降到0.215pA RMS。当探头回到局部屏蔽保护范围时，噪声则恢复到0.11pA RMS的水平。
2.4 讨论
在做局部屏蔽时，要注意避免出现多点接地。但在实际操作中，常常由于不清楚仪器内部的接地电路而导致多点接地。例如BNC的屏蔽层通常和仪器信号地互通，而不同仪器的信号地可能被连接在分离的电源地上。如果断开BNC屏蔽层或者断开某些电源地线，就可能消除环路。
在膜片钳系统中“接地端子”可以分成两种：一种是信号地(Signal GND)：这一般由放大器提供，是放大器信号的0V参考点。另一种机箱地(Chassis GND)：一般与整个机箱导通；有些设备上往往没有预先设置好的机箱地，这时可以选择机箱上某个裸露金属部分例如螺丝做接点。机箱地一般与三芯插座的“电源安全接地”互通。如果交流供电系统的“电源安全接地”是接大地的，则整个机箱也就接大地了。我们强调必须要检查供电系统的“安全地线”是否真正的接了大地。因为我们发现有些实验室的“电源安全接地”是悬空的，其他房间的强电设备如果也使用此悬空的“电源安全接地”，一旦强电设备漏电，就会对所有使用这个“安全地”的设备造成威胁。
3. 机械干扰分析及处理
在膜片钳系统中，导致电极尖端的机械震动和漂移是两种主要的机械干扰。
3.1 隔离系统震动
震动会直接导致封接失败和记录错误。引起震动或晃动主要是来自地面的垂直震动、空气流动和声波振动。具有良好缓冲性能的防震台可以有效隔离来自地面的垂直震动[2]。对于防震台上方的各种震动波动干扰，可以在屏蔽笼内部使用一层丙烯酸塑料环绕以阻断空气流动，并用填充泡末塑料，以消除声音振动的影响。如果实验室在地下室，或者选择半夜做实验，可以避免白天的许多震动来源。
3.2 防止系统漂移
在膜片钳实验中使用的记录微操必须坚固紧凑，其移动部分(包括微操、夹持器、电极尖端、chamber中的细胞)应尽可能短。微操应最好直接安装在显微镜加宽平台上。放大器探头应直接固定在微操上，要极力避免头重脚轻的结构，防止产生惯性震颤。美国Burleigh公司PCS5000/6000系列压电晶体微操和Sutter公司MP285系列马达微操性能都非常优良。而液压驱动的微操则由于液体的膨胀系数的缘故更容易发生漂移。在实验中，震动干扰往往容易察觉到并能及时消除。而对缓慢的电极尖端的漂移，则困难得多，往往要花很长时间来观察和判断[9]。漂移可定义为电极尖端相对细胞的移动，在高放大倍数物镜和CCD监视系统中可以观察到。引起电极漂移的原因可以是电极、探头、夹持器、微操、固定装置、显微镜体、显微镜平台，甚至细胞样本。一旦观察到漂移，需要反复观察判断，以定位漂移原因。根据我们对PCS5000和MP285微操的分析和实际使用经验，一般可按如下优先顺序检查：
3.2.1 检查温度变化情况和使用的材料。
温度是引起漂移的一个重要原因。例如将手掌靠近探头夹持器，手掌的温度就足以产生明显的漂移。因此我们要使系统避开例如空调出风口、窗户、日照，以及其他任何冷热源，使温度变化尽可能小。并且在与电极尖端位置有关的机械连接范围内避免使用温度敏感材料例如聚合材料。（部分物质的膨胀系数：石英玻璃0.56，硅酸盐玻璃3.2，不锈钢12，铝22）。石英玻璃的热稳定性最好[11]。铝也不错，它有高热导率，能快速散热。当使用同一种材料时，缓慢温度变化造成的膨胀是一致的，不至于产生明显的漂移。但在某些极端敏感的情况下，甚至需要用反光塑料来隔离实验人员的体温对系统的影响。
3.2.2 检查所有的机械连接。
我们可以抓住探头轻微尝试在所有方向上来回快速移动。如果手指感觉到细微的卡拉声，说明系统某处有松动。另一个测试是轻轻敲打显微镜并观察电极尖端，如果电极过分颤动，表明问题来自固定微操的平台。
3.2.3 检查探头和电极夹持器。
我们卸下探头，将玻璃电极直接固定在微操上，可检查电极尖端是否漂移。我们根据经验判断，大多数漂移都是探头和电极夹持器导致的。为了消除施加负压的胶皮管对夹持器的应力，需要选择尽可能软且轻的加胶皮管并固定在探头或悬挂以消除重力的影响。Axon公司早期的探头HL-1/2使用的是无螺纹固定的夹持器，固定依靠锥形特弗隆插头和插座的摩擦力，在多次使用后，摩擦引起特弗隆变形而使这种连接变得不稳定。Axon后来改进的HL-U，使用了螺纹连接，但旋上HL-U时切忌过分用力紧固，否则特弗隆螺纹的缓慢松弛会导致严重的漂移。HEKA公司的夹持器非常稳定。HEKA使用了一个优质BNC插头来固定夹持器到探头上。这种连接配合紧密，机械稳定性非常好。HEKA还加长了螺帽，并在螺帽中插入了一个圆柱，该圆柱可以精确引导和固定两个O型圈，以消除在夹持器内的电极移动。第三个在金属针尾端的O型圈可以防止整个夹持器相对BNC插座的移动，该设计还保证了当施加负压时，不会引起电极移动。
3.2.4 检查电缆的应力。
我们需要确保微操各个轴能够全程平滑移动，这可以检查微操驱动器是否工作正常，移动轴有没有阻碍。要保证所有电缆是自由放置的，没有给微操施加作用力。更换电极时，微操和探头电缆都有明显扭动，这会产生剩余应力，当这些应力慢慢释放时就会导致漂移。如果观察到的漂移在几分钟内有几个微米，漂移可能就来自电缆应力。我们可将微操电缆盘成柔软的大圈环，并使所有电缆在微操直线运动和旋转运动范围内都是松软的。在微操运行时，电缆不能被挤压拉伸。我们还可以将所有的电缆都垂直支持悬挂在微操的中心线上方，可以最小化应力。
4. 小结
本文主要讨论了膜片钳记录系统中的电学噪声和机械干扰问题。我们仔细分析了各种干扰的来源，并给出了许多有效的解决措施。这是我们近些年来安装调试多套HEKA和Axon系列膜片钳系统的经验总结。我们的分析结论和处理方法，对于国内许多膜片钳实验室进一步优化系统，具有参考价值。膜片钳单通道记录对低噪声、低震动和低漂移的要求是非常高的，因此本文对于常规电生理记录系统，也具有一定参考意义。
参 考 文 献
[1] E Neher ,B Sakman. The Patch Clamp Technique. Sci . Amer . ,1992 ,Mar :44 ～51
[2] Rivka Sherman-Gold,, The Axon Guide for Electrophysiology Techniques, Axon Instruments, Inc.,1993,19-23.
[3] 周专,康华光.膜片钳系统的噪声分析[J ] ; 中国生物医学工程学报,1992 ,11(2) :128 - 137.
[4] 康华光.细胞电生理与膜片钳技术[J ]; 中国医疗器械杂志, 2000, 24 (3) : 155- 160.
[5] 娄雪林,周专.康华光单通道和全细胞记录技术[J]; 中国医疗器械杂志, 2000, 24(4): 221- 226.
[6] Axon, Axopatch200B_manual_Rev_D, 2001, Specifications, 103-105.
[7] Axon, MultiClamp700B_manual_Rev_C, 2004, Specifications, 141-146.
[8] HEKA , Low-Noise Recording, Heka EPC10_manual, 2003, 66-68.
[9] Pipette Drift Sources and Solutions for Patch Clamp Recording Experiments, Burleigh Instruments , Inc. Application Note
[10] Richard A, Rae, JamesL, Low-Noise PatchClamp Techniques. Methods Enzymology. 1998, 293:218-266
[11] F.Sachs., A Low Drift Micromanipulator Holder, European Journal of Physiology 1995, 429:434-435.
电极尖端形态控制技巧――怎样得到最佳电极
制作微电极时，我们最关心的是微电极的尖端锥度和尖端直径。
在调节控制微电极的尖端锥度和尖端直径时，下面的参数对照表格或许对您有帮助。在每次仅操纵一个参数时，拉制微电极形态过程中，这表格体现了不同参数对微电极尖端形态的影响。举个例子，如果所有参数保持不变，只减少VELOCITY，您将增大微玻管的尖端直径。我们推荐您逐步的改变各个参数（每次五个参数）来达到最适合您的设置。这是一个不拘泥的指导思想。为了得到期望的微玻管的两个指标，就要进行多次试验。
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参数 |
增大 |
减小 |
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Heat |
尖端直径减小
锥形增长
阻抗增高 |
尖端直径增大
锥形减短
阻抗降低 |
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Pull |
尖端直径减小
锥形增长 |
尖端直径增大
锥形减短 |
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Velocity |
尖端直径减小 |
尖端直径增大 |
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Time |
锥形减短 |
锥形增长 |
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Pressure
(Air flow) |
锥形减短
阻抗降低 |
锥形增长
阻抗增高 |
