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技术文萃信息：
膜片钳实验系统配置
Sutter公司P-97玻璃电极拉制仪
Sutter公司MP-285微操纵器
一种基于玻璃微管内封接技术的膜片钳方法
EPC7/PC2/200B膜片钳系统中的光电联合检测技术的实现
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※ 疑难解答 ※
膜片钳实验系统配置
一个电生理配置有4个主要的需求：
环境需求：保持标本的健康的手段。
光学需求：显现标本以供观察的手段。
机械结构需求：稳定定位微电极的手段。
电子学需求：放大和测量信号的手段。
我们将配置分成两种类型的“典型”配置：胞外记录和单通道膜片钳记录。
胞外记录的配置
该配置主要用于记录脑片的场电位。一般目标是将一个相对粗糙的电极放置在组织的胞外空间，同时尽可能模仿体内的组织环境。因此，需要一个相当复杂的小空腔，用来对组织进行温暖、氧化、灌注。而另一方面，光学和机械结构需求则简单得多。一个解剖用显微镜，至少15cm的工作距离(配合近似垂直放置的微操纵器)，通常已经可以看到切片或大体的形态学特征。由于对定位时手的震动和电极的精确放置都没有苛刻要求，微操纵器可以选用相对粗糙的机械类型。但是，在记录过程中，微操纵器不允许有一点漂移和震动。
需要使用低噪声的电压放大器。由于信号的范围可能在10 uV 到10 mV 范围内，低噪声电压放大器的增益至少要达到1000。
单通道膜片钳记录配置
标准的膜片钳配置在许多方面与胞外记录恰好颠倒过来了。由于对环境的控制非常少，实验通常在室温下、一个无灌注的培养皿中进行。
光学和机械需求则根据实际的细胞的大小(10或20 um)有特殊的规定。显微镜应该有放大300或400倍的能力，并需要某种对照增强能力(Nomarski, Phase or Hoffman)。omarski(微分干涉)对于电极的精确放置是最好的，因为它的影像依赖于视野一个很窄的深度上，这有助于精确定位(定位不好，影像是模糊的)。Phase(相差法)用于精确定位程度要求低一些的场合，但提供了更好的对比度。Hoffman方法提供了较便宜的，稍微退化点的Nomarski版本。
最好使用倒置显微镜：
(1) (1) 这样能使电极顶端更容易被看到，因为物镜在chamber的下方，
(2) (2) 提供了更大更坚固的平台，用来固定微操纵器。
微操纵器应提供良好的，平滑的移动(最多每秒2um)。对震动和稳定性的需求决定于记录模式：是希望记录cell-attached- patch，还是cell-free (inside-out or outside-out) patch。
在cell-free- patch中，微操纵器只需要在形成封接过程中保持稳定，一旦离开了细胞，稳定就不是那么至关重要了。这通常不到一分钟。
单通道记录的放大器比胞外记录使用的要复杂得多。象Heka公司的EPC9,EPC10以及Axon公司的Axopatch200B都是非常优秀的膜片钳放大器。
组织切片膜片钳记录配置
膜片钳技术的近来扩展，切片膜片钳技术，其配置需要是体外胞外记录和常规膜片钳配置的一个组合。例如，该技术可能需要一个chamber，需要连续对切片进行灌流和供氧。大部分的其他要求，与常规膜片钳类似。光学需求与切片的厚度有关(thick-slice or thin-slice)，对thick-slice，简单的解剖显微镜就够了；而对thin-slice，显微镜则需要提供400倍的放大，良好的顶端聚焦和对照增强。
设备放置
电生理实验人员倾向于在小房间的一角独自工作。小房间通常比较安静，震动和空气流动被削减了。
首先放置显微镜是比较明智的，然后是密切联系的附件，例如chamber，微操纵器和温度控制系统(如果安装了)。基本原则是第一要保证细胞恰当的处于静止状态，第二要确认从细胞记录信息的行为没有对细胞带来连续的致命伤害。
第一原则可以通过良好的实验环境帮助实现，第二原则通过良好的光学和机械手段实现。
在显微镜周围工作，保持例如灌注阀门和微操纵器的控制要非常谨慎，避免震动。理想的情况是，它们放置在一个小架子上，该架子从防震台延伸出来，保证在通过显微镜观察细胞时，不会产生破坏的震动。
选择和放置电子仪器是个人偏好的事情。最低的要求是只有一个放大器和一台计算机，另外强调最好放置在一个仪器架上。一个示波器是重要的，因为，计算机通常不够灵活；而且，示波器常能展现在计算机屏幕上看不到的一些意外情况，例如计算机的采样率设置不合适时，就会丢失大量细节信息，而示波器则不会。
示波器应与眼睛水平，在示波器上面或下面直接放置微电极放大器，以便容易的调整和监视信号。
最后，计算机应放置得尽可能远，但离显微镜还是应该保持在手臂来回够得着的地方。这有助于削减显示器的辐射噪声，也能确保在使用键盘匆忙记录时不至于肘部撞击显微镜。
最后一般的建议，也许是最难注意的是：抵制十全十美的配置诱惑，只要有一半的可能性，就开始实验。
SUTTER公司P-97微电极拉制仪使用说明
一．前后面板（按钮、开关、旋钮）控制的功能及作用
1． 前面板
LCD Display： 显示程序参数
Reset： 初始化复位控制
Air Pressure： 在拉制周期的有效制冷状态期间设置空气压力的值
Keypad： 用于设置程序参数值和执行程序
0~9： 用于选择所要的程序或控制功能，当程序设计时输入数字值和作决定是/否（Yes/No）（1/0）
CLR： 进入某个程序后本键用于删除程序或数值，也用于作坡度测试（RAMP TEST）的入口
ENTER： 回车，确定新数值或程序
NEXT： 编辑时移动到程序的下一行
LAST： 编辑时移动到程序的上一行
PULL： 开始执行程序
STOP： 终止执行程序
LED Display显示：
Program(0-9)：一个程序由一行（Cycle）或多行组成（一个Cycle包括4个程序参数：HEAT、PULL、 VELOCITY、TIME，一个Cycle相当于一行程序代码）。当执行拉制一支嵌入仪器的毛细玻璃管时，一个程序能连续拉16Cycles长度。
HEAT：HEAT是控制一个供给加热片的电流水平，设置加热片的功能，使之能熔化特定的玻璃管（组成物质及大小），在操作部分讨论坡度测试的相对值很重要，它就是你所要的加热（HEAT）值。
PULL：Pull控制强加给的拉力，一般较高的pull值会产生较小的和较长的锥形尖端。
VELOCITY：拉制杆移动速度达到一定程度，拉断电极。
TIME：TIME控制有效的制冷空气时间长度。
2． 后面板说明
1）电压转换器，国内使用220V，应使Δ对准220V。
2）电源接口及保险丝（电源开关在左侧面）。
二．安装及使用
1． 使电压对准220V，并插上电源线。
2．打开左侧的开关。
3． 安装玻璃管。
4． 运行RAMP TEST坡度测试，这测试是让你确定加热值，加热值能够熔化玻璃但又不至于烧断加热片。当你第一次使用拉制仪或更换加热丝、更换不同型号的玻璃时，都应该作RAMP TEST坡度测试，然后把RAMP TEST的值当做你的新编辑的程序的HEAT值。下面是运行RAMP TEST的步骤：
* 进入任一程序（按0-9 Enter回车）。
*按清除键<CLR>进入控制功能。
*按<0>不要清除参数数值。
*按<1>即能运行RAMP TEST 坡度测试。
*安装玻璃管和按<PULL>。
* 记录RAMP TEST值，将用于设置HEAT。
运行RAMP TEST时幸韵孪窒蠓⑸?BR>*HEAT值逐一增加。
*当加热值达到一定程度开始软化玻璃时，拉制杆将有小的移动；
*当移动速度达到一定程度，加热关闭。
*RAMP TEST值也不再增加并显示出来。
做完RAMP TEST后记下它的值按RESET。
5． 进入<0>显示程序0，光标将闪烁在HEAT，检查参数是否符合RAMP TEST值，否则改变它，按PULL。
6． 松开夹子旋钮拿出微玻璃管。
*按RESET退出程序0；
*按<1>进入程序1再做测试。
三．注意事项
1，安放加热片要在吹气孔的正中间，不能和微玻管有任何接触。
2，程序0、程序1是系统设置的程序，配合随机器的微玻管作显示用，用户要根据自己的需要先通过RAMP TEST确定HEAT值，再不断调整PULL、VELOCITY、TIME值，使之做一步二步甚至多步拉制达到自己的应用目的。
（详细使用请查阅英文使用说明书）
EPC7/PC2/200B膜片钳系统中的光电联合检测技术的实现
摘 要： 本文系统介绍了荧光测钙系统的光源选择，在Heka系统和Axon系统中的实现。对于大量应用Axon膜片钳的实验室扩展系统功能时，具有参考价值。
关键词: 膜片钳系统，荧光测钙
【引言光电联合检测技术】
细胞内自由钙离子浓度及其变化在细胞生理活动中有着重要的作用，是细胞信畔低持械闹匾方?/SPAN>,调节着肌肉收缩、分泌活动、电兴奋性等诸多重要的细胞功能。在不同生理条件下测定活体细胞的钙离子浓度是细胞生物物理研究的一个重要内容[1] 。由于以荧光标记法测定活体细胞[Ca2+]i具有快速、无损伤等诸多优点，故基于荧光标记法的活细胞钙离子浓度检测系统在目前得到了广泛应用。
Neher等于1986年将膜片钳技术与Fura-2荧光测钙技术进行了有机的结合。即在做全细胞之前，以孵育的方法或经电极扩散的方法使荧光染料Fura-2进入细胞内，对细胞进行荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞膜电容等多指标测量，从而得出同一事件过程中各种因素同时变化的情况，分析诸参量间的相互关系，揭示出更多的细节信息[?]。目前，这种光电联合检测技术已经发展得非常成熟，在单细胞电生理多变量检测实验中得到广泛应用。
比较典型实现的是德国HEKA公司的EPC9/10膜片钳系统和德国TILL公司的Poly4/5荧光测钙系统的集成[?]。而国内许多膜片钳实验室运行着大量的EPC7/PC2/200B膜片钳系统，一般却没有合适配套的荧光测钙系统，尤其在EPC7/PC2/200B膜片钳系统与荧光测钙系统的集成应用方面，还没有合适的介绍。
根据EPC7/PC2/200B系列放大器和 其配套软件包的功能，利用TILL-Poly4/5和Sutter- DG4，TILL-FDU，我们首先实现了基于Axon pClamp软件的光电联合检测系统，可以满足部分实验需求。在此基础上，我们开发了CytoClamp软件包，该软件完全兼容pClamp软件并提供了完整的光电联合检测功能，全面支持EPC7/PC2/200B膜片钳放大器。
【系统实现】
如图，是一套完整的基于EPC7/PC2/200B膜片钳放大器的光电联合检测系统。荧光测钙部分可分为光源模块、显微镜模块、荧光采集模块（如图1所示）。膜片钳记录部分则由放大器，微操，膜片钳实验软件包等构成。单色激发光源输出的单色激发光通过光纤与耦合器进入显微镜光路并聚焦于样本平面，激发细胞中的荧光探针发出荧光，荧光信号通过PMT /CCD记录。
【荧光测钙系统中的光源和检测设备】
【光源】一般选用从紫外(300nm )到黄绿光(595nm ) 这段波长范围内的光谱比较平坦的氙灯。荧光显微镜中常规使用的汞灯，其光谱不够平坦，只在某些特殊波长位置有很大的能量峰，不适合用于动态定量检测。氙灯光源需要保证输出的激发光波长可以快速切换，有足够的输出能量密度，有足够的光谱纯度。
目前应用较多的单庠词堑鹿?/SPAN>TILL公司的Poly4/5和美国Sutter公司的DG-4。Poly4,5的输出波长在260nm到650nm之间连续可调，在340nm/380nm之间波长切换时间小于1ms，光谱带宽15nm，控制方式：外加模拟电压控制波长切换，RS232控制，本地编程控制。
Sutter DG-4输出波长在300nm到700nm之间，有4个单色滤镜可以使用，对于典型的fura-2荧光染料，可使用340nm/380nm的单色滤镜，波长切换时间2ms。控制方式: TTL电平控制对应的滤镜，RS232控制，并行口控制，本地编程控制。
【显微镜】具有激发光引入光路的荧光显微镜，例如Olympus IX70/71。
【检测设备】如果只关心某个区域内的平均荧光亮度，即光度术检测，我们可以使用高灵敏度的光电二极管或光电倍增管。如果关心荧光影像，则需要使用CCD。我们在这里介绍的荧光光度术检测。我们以德国TILL公司的荧光检测FDU组件为例。FDU组件包含ViewFinder、光电二极管、信号放大调理模块，FDU的输出信号可直接输入到数据采集装置上。
【Fura-2显微荧光测钙技术的原理】
图2荧光染料测游离钙浓度的基本原理
A: 荧光检测设备框图；B:fura-2激发光谱曲线；C:双波长测量时序图
在激发荧光波长为340nm左右时，当fura-2结合了钙时，其荧光强度上升；而在激发荧光波长为380nm左右时，当它结合钙时，荧光强度会下降；在fura-2的等消光点360nm时(图2-B中箭头所指位置)，fura-2的荧光强度与钙浓度无关。这样，自由钙浓度可以直接由两个激发波长上的荧光强度的比值来计算出来，即双激发波长荧光法。这种比值法可排除因Fura-2本身浓度的变化、光学通路的变化、以及仪器灵敏性的变化等因素引入的误差。选择对钙离子不敏感的激发波长360nm则是用来反应细胞内荧光染料的总量，可以监视细胞内染料总量变化的过程。
计算胞内游离钙离子浓度的公式如下：
其中Keff为有效结合常数。R为两种激发波长下荧光强度的比值，即R＝F(λ1)/F(λ2)。当λ1为340nm, λ2为380nm时，R＝（F340）/（F380）。在再考虑背景激发波长产生的荧光FB，则还可减去背景光强度，即R＝（F340－FB）/（F380 －FB）。Rmin是在零钙浓度下的最小荧光比值，Rmax则为在高钙浓度（10mM)时的最大荧光比值。对于不同的时间、不同的系统,Keff、Rmax、Rmin这三个参数都不相同。因此，需要定期校准。
【在pClamp软件中具体实现光电联合检测】
对图3中的有关参量解释如下：积分时间 it1和it2分别是测量F(λ1)和F(λ2)时间长度，将这段时间内的荧光强度进行积分，作为这段时间内的平均荧光强度。死区时间dt是单色光源切换波长的过渡时间，死区时间内的荧光信号没有意义。循环时间st(sweep time)是一个完整的双波长测量所需要的时间，和pClamp软件中Episodic模式的Sweep概念等效。每经过一个Sweep，根据前面介绍的计算公式，可得到一个钙浓度值。
荧光检测模块FDU提供两种信号输出，一种是原始的荧光强度信号F(λ1,λ2)，根据荧光检测Sweep的it1、it2、dt、st，可计算出F(λ1)和F(λ2)和浓度值。这种荧光信号输出模式与Axon的Episodic记录模式匹配。
而另一种直接输出FDU内部解析出来的F(λ1)和F(λ2)，利用pClamp软件包中的数学通路功能，可根据浓度计算公式得到浓度值，这种信号输出模式与Axon的Gapfree记录模式匹配。
图3中给出了有关的信号流向和连接。
l l 激发光源的控制
TILL-Poly4/5光源：
Episodic模式：使用DD1322的模拟输出电压(±10V)去控制260nm-650nm的任意波长，例如-1.7V输出340nm，-1.2V输出
